马相伯，原名志德，亦名建常，改名良，字相伯，祖籍江苏丹阳。1840年（清道光二十年）阴历3月17日生于江苏丹徒(今镇江市)一个数代笃信天主教的家庭中。他父亲以教书、行医为业，也开过药铺、布店及米店。因为父母信奉天主教，所以马相伯襁褓间便受洗礼，洗名若瑟。

    他5岁入学，先学天主教经典，后学儒家书籍。马相伯对儒家经典的烦琐考据不感兴趣，而对天像运行，则喜欢寻根究底。12岁时，经友人介绍，背着父母独自离家，用了十天的功夫从镇江来到上海，进入天主教耶稣会开设在上海徐家汇的依纳爵公学(1927年改校名为徐汇公学，现名徐汇中学)读书。马相伯在依纳爵公学读书期间，学习勤奋，对自然科学与数学尤其感兴趣。15岁时他开始学习法文和拉丁文，成绩优良，多次受到嘉奖。20岁时学习希腊文。1862年，耶稣会在上海设立初学院，马相伯进院当修士，接受“神修”训练。初学院学习期满后，他进入大学院学习哲学与神学，31岁时获神学博士，并加入耶稣会，授职为司铎(神父)。

    1902年11月，南洋公学(今交通大学)学生反对学校当局的专制压迫，集体退学，蔡元培介绍部分退学学生到马相伯处求学。当时已年过六十的马相伯先生欣然允诺，将属于自己名下的祖传家产——松江、青浦良田三千三百亩捐献出来，创办复旦大学的前身震旦学院，他亲自出任院监。震旦学院的创办得到了法国教会的资助。 当时法国教会将徐家汇老天文台给震旦作校址,并派了数名外国司铎（神父）担任义务讲座,震旦遂于1903年3月1日开学上课。定名为“震旦”，其意为中国之曙光。1905年，马相伯先生又与严复等创办复旦公学，任复旦公学首任校长。此后六七年间，马相伯先生的精力几乎大半耗于复旦公学。历年延聘名师，整理科目，使之成为东南重要学府，复旦能由公学扩大而为大学，正赖于此。

    马相伯办学之目的，在于救国。震旦学院以崇尚科学、注重文艺为办学方针。他亲自授课，于右任、邵力子、马君武等人都是该院学生。1908年震旦学院拟在法租界建设新校舍，向马相伯募捐，他为震旦购买了卢家湾基地100亩共捐现金40000元，又捐英、法租界地基8处，约值现金10余万元。马相伯将全部家产都捐给了震旦。他还将自己历年所积薪金10000元捐献给启明女中，晚年一度靠翻译为生，后来在震旦领取生活费。

    “九· 一八”事变后，马相伯积极参加救国工作，坚持主张“立息内争，共御外侮”；他发表演说，书写文章，号召团结抗日，呼吁人民自救，因而被尊称为爱国老人。1935年12月12日，上海文化界组织救国会，由于马相伯的社会地位和救国热情，被公认为救国领袖，一切通电、文件均由他领衔。后来组织的全国各界救援会一切文件也均由马相伯领衔。

    1937年抗战全面爆发，马相伯撤退至昆明途中因病滞留越南谅山。1939年11月4日在谅山因病逝世，享年100岁。